Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — это один из методов молекулярно-биологической, или ДНК-диагностики. Его суть заключается в обнаружении инфекционного возбудителя в биологическом образце генетического материала (ДНК или РНК).
Исследования проводятся на базе клинико-диагностической лаборатории. Её оборудуют, согласно требованиям, которые предъявляются к данному типу лабораторий.
Например, стандарты оснащения лаборатории, которая работает на базе кожно-венерологического диспансера, утверждены в Приказе Министерства здравоохранения РФ от 15 ноября 20102 г. №924 (приложение №16 к «Порядку оказания медицинской помощи по профилю «дерматовенерология»).
Исследования в ПЦР лаборатории
В лаборатории проводится широкий спектр исследований. С помощью полимеразной цепной реакции можно выявить вирусные гепатиты B, C, D, G; урогенитальные инфекции; инфекции, которые передаются половым путем (ИППП), папиломмавирусные, TORCH и герпесвирусные инфекции; оппортунистические, гнойно-септические, внутриутробные, кишечные и нейроинфекции; инфекции дыхательного тракта.
ПЦР анализ. Обзорное видео #дневникаспиранта (носит информативный характер!)
ПЦР-диагностика очень эффективна, поскольку позволяет выявить возбудителя инфекции и диагностировать заболевание ещё до его клинических проявлений. При этом исключаются ложные результаты.
Требования к помещению
В лаборатории выделяют рабочие зоны, которые соответствуют этапам ПЦР-анализа:
- Для приёма, регистрации, разбора и первичной обработки биоматериала. Здесь принимают, сортируют, маркируют и хранят материал.
- Для выделения ДНК/РНК. Оптимально размещать зону в отдельном помещении, но допускается и размещение в помещениях, где проводят другие исследования (кроме генно-инженерных!). В последнем случае необходимо оборудовать ПЦР-бокс или бокс биологической безопасности, в котором запрещено проводить любые другие методы исследований, кроме ПЦР. Под зону выделяют помещение площадью 15–20 кв. м.
- Для приготовления реакционных смесей и проведения исследований. Здесь готовят ПЦР-смеси, вносят выделенные препараты ДНК/РНК в пробирку для ПЦР. Оптимальная площадь помещения 15–20 кв. м.
Этапы выделения ДНК/РНК и приготовления смесей проводят в разных помещениях. Однако допускается совместить их. В таком случае обязательно оборудуют боксы – отдельный для каждого этапа. - Для детекции продуктов амплификации. Оптимально размещать зону в отдельном помещении, в котором имеется ПЦР-бокс. Обычно при детекции используют метод электрофореза и гибридизационного анализа. Если необходимо использовать оба метода одновременно, необходимо выделить отдельную зону для проведения гибридизационного анализа. При этом расходные материалы и посуду для каждого метода используют свою. Оптимальная площадь помещения для детекции составляет 25–30 кв. м.
Если в лаборатории применяют метод real-time PCR, то не нужно выделять зону детекции.
Что такое ПЦР?
Кроме рабочих зон, необходимо выделить и вспомогательные помещения: архива (для хранения документации), комнаты для персонала (отдыха, приёма пищи), раздевалки, кабинета заведующего, склада, санузла.
При возможности рекомендовано выделить отдельное помещение под автоклавную для обеззараживания исследуемого материала. Если такой возможности нет, то при соблюдении правил биологической безопасности допускается общая с другими подразделениями лаборатории автоклавная.
Кроме обязательного зонирования, к помещению ПЦР-лаборатории предъявляются такие технические требования: наличие водопровода, канализации, электричества, отопления, освещения (естественного и искусственного), приточно-вытяжной или вытяжной вентиляции, систем кондиционирования и пожаротушения.
Не допускается воздухообмен между зоной детекции и остальными зонами.
Внутренняя отделка
Стены, потолок и пол должны иметь гладкую поверхность без щелей, стыков, трещин, а пол – покрыт антискользящим материалом. Они должны быть устойчивыми к воздействию дезинфицирующих и моющих средств, легко обрабатываться.
Согласно «Методическим указаниям по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхности в помещениях», во всех рабочих зонах ПЦР-лаборатории устанавливают бактерицидные лампы из расчёта 2,5 Вт/куб. м.
Оборудование и мебель
Согласно Стандарту оснащения молекулярно-биологического подразделения клинико-диагностической лаборатории, необходимо такое оборудование: термостат твердотельный для пробирок типа Эппендорф, аплификатор, насос с колбой-ловушкой, микроцентрифуга для пробирок, центрифуга-встряхиватель (вортекс), настольный бокс для ПЦР, трансиллюминатор, аппарат для проведения горизонтального электрофореза с источником питания, Прибор для чтения результатов исследования на биомикрочипах (ДНК-чипах), камера для гибридизации (для проведения исследований на биомикрочипах), комплект оборудования для проведения исследований методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, наборы одно- и восьмиканальных пипеточных дозаторов, холодильники (бытовой и низкотемпературный от –70 до –80 °С).
Также ПЦР-лабораторию нужно оснастить: системой гель-электрофореза (для отображения результатов) и гель-документации (для их анализа).
В ПЦР-лаборатории устанавливают медицинскую мебель — рабочие столы, стулья, тумбочки, полки и шкафы (для хранения посуды, материалов и т. д., а также документации).
Главные требования к медицинской лабораторной мебели — эргономичный дизайн, удобство, долговечность, устойчивость к воздействию химических и других веществ.
Источник: kranz.ru
Эпидемиология. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности
1. Разработаны: Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Е.Н.Беляев, И.В.Брагина, С.Г.Домнин, М.В.Зароченцев, Э.Ф.Опочинский, Т.В.Воронцова), Центром по генной диагностике особо опасных инфекционных заболеваний Минздрава России на базе Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (А.Н.Куличенко, Н.А.Осина, И.Н.Шарова, М.Н.Ляпин, И.Г.Дроздов, В.В.Кутырев), Противочумным центром Минздрава России (В.Е.Безсмертный, С.М.Иванова, Ю.А.Панин), ООО «Биоком» (А.В.Сычев, А.Б.Комаров, Л.А.Сердобинский).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 4 марта 2004 г.
3. С введением настоящих Методических указаний теряют силу «Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения», утвержденные заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора Г.Г.Онищенко 22.06.95.
1. Область применения
1.1. Настоящие Методические указания устанавливают требования к помещениям лабораторий и порядку проведения в них работ с патогенными биологическими агентами (ПБА) III-IV групп патогенности с использованием методов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР).
1.2. Методические указания регламентируют выполнение исследований методом ПЦР с применением оборудования и тест-систем, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке.
1.3. Методические указания определяют принципы организации работы лабораторий, использующих метод полимеразной цепной реакции, на этапах выполнения ПЦР-анализа.
2. Нормативные ссылки
2.1. СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами». Минздрав России, 1999.
2.2. СП 1.2.1318-03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами». Минздрав России, 2003.
2.3. СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». Госкомсанэпиднадзор России, 1995.
2.4. МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности». Минздрав России, 2003.
2.5. МУ 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности при работе методом ПЦР». Минздрав России, 2001.
2.6. «Методические указания по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях» N 11-16/03-06 от 28.02.95. Минздравмедпром России, 1995.
3. Общие положения
3.1. Полимеразная цепная реакция представляет собой процесс многократного увеличения числа копий (амплификация) фрагмента ДНК-мишени (кДНК), катализируемый in vitro термостабильной ДНК-полимеразой, и позволяет обнаружить специфичный участок генома биологического агента.
3.2. ПЦР обладает высокой чувствительностью, специфичностью, обеспечивает возможность работы практически с любым видом биологического материала и объектами окружающей среды, позволяет выполнять анализ в течение 4-8 ч. Аналитическая чувствительность тест-систем для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов методом ПЦР составляет 1 x 10 2 — 1 x 10 4 м.к. (геномэквивалент/мл), специфичность — 85-100%.
3.3. По результатам анализа выдают предварительный ответ о наличии в пробе специфических участков (фрагментов) ДНК или РНК, имеющих гомологию с определенным участком генома возбудителя того или иного инфекционного заболевания, а также о наличии в исследуемом материале генетических маркеров или генетически модифицированных ДНК.
3.4. Проведение исследований методом ПЦР сопряжено с необходимостью обеспечения соблюдения правил биологической безопасности, а также определенных требований к организации и проведению анализа с целью предотвращения контаминации исследуемых проб нуклеиновыми кислотами и получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
4. Требования к организации работы
с ПБА III-IV групп патогенности методом ПЦР
4.1. Общие требования
4.1.1. Работу с ПБА III-IV групп патогенности методом ПЦР проводят только при наличии в организации лицензии на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний человека и санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения соответствующих работ в лаборатории, выданных в установленном порядке.
4.1.2. Организацию работ на этапах приема, разбора и первичной обработки материала, подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот, а также обеззараживания проб проводят в соответствии с требованиями СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами». Работу на остальных этапах ПЦР-анализа проводят как с обеззараженным материалом.
4.1.3. В лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с ПБА III группы патогенности, допускается проведение исследований методом ПЦР (без предварительного накопления возбудителя) с целью диагностики бруцеллеза, парентеральных вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции, возбудители которых относятся ко II группе патогенности.
4.2. Требования к помещениям ПЦР-лаборатории
4.2.1. Помещения ПЦР-лаборатории, проводящей работы с ПБА III-IV групп патогенности, должны соответствовать требованиям СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами».
4.2.2. Проведение исследований методом ПЦР с ПБА III-IV групп патогенности допускается на базе действующих микробиологических (бактериологических, вирусологических, иммунологических и др.) лабораторий при условии соблюдения требований СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами» и организации в лаборатории самостоятельных или выделенных в составе других функциональных помещений рабочих зон, соответствующих этапам ПЦР-анализа.
4.2.3. ПЦР-лаборатория должна включать следующий минимальный набор рабочих зон:
— приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала;
— приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР;
— детекции продуктов амплификации методом электрофореза или ГиФА.
4.2.4. В ПЦР-лабораториях необходимо также предусмотреть наличие вспомогательных помещений (комнаты ведения учетных документов или ординаторской (комнаты персонала) ; кабинета заведующего лабораторией ; раздевалки для сотрудников <**>; комнаты приема пищи <**>; туалета <**>; подсобных (складских) помещений <**>).
Помещения могут быть объединены.
<**>Помещения могут быть общими с другими подразделениями учреждения.
4.2.5. Необходимо наличие автоклавной комнаты для обеззараживания исследуемого материала. Она может быть общей с другими подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности.
4.2.6. Помещения для выполнения работ на этапах ПЦР-анализа должны быть боксированными (боксы с предбоксами).
4.2.7. В зоне приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала проводят прием ПБА, пробоподготовку (сортировку, маркировку, центрифугирование и др.), хранение и первичную инактивацию остатков биоматериала дезинфицирующими средствами. Зону приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала располагают в комнате приема материала или в отдельном боксированном помещении. Здесь же можно проводить прием и обработку проб для исследования другими методами (бактериологическими, вирусологическими, иммунологическими и т.д.), при условии выделения отдельного оборудованного рабочего места для ПЦР-анализа.
4.2.8. Зону выделения нуклеиновых кислот размещают в отдельном помещении. При организации ПЦР-лаборатории на базе действующей микробиологической лаборатории допускается выделение НК в помещениях, в которых проводят другие виды исследований, кроме генно-инженерных работ и работ по накоплению ПБА. В этом случае в помещении организуют рабочую зону для выделения нуклеиновых кислот (НК), в которой располагают ПЦР-бокс или бокс биологической безопасности. В ПЦР-боксе (или боксе биологической безопасности) для выделения НК не допускается проведение других работ.
4.2.9. В зоне приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР производят приготовление ПЦР-смеси, внесение в пробирку для ПЦР выделенных препаратов ДНК или кДНК, обратную транскрипцию РНК и амплификацию ДНК или кДНК. Помещение для приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР должно быть отдельным. Приготовление реакционных ПЦР-смесей проводят в ПЦР-боксе.
4.2.10. При необходимости этап выделения НК может быть совмещен в одном помещении с этапом приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР при наличии в нем отдельных ПЦР-боксов (боксов биологической безопасности) — для подготовки реакционных ПЦР-смесей и для выделения НК.
4.2.11. Зону детекции продуктов амплификации располагают в отдельном помещении, по возможности оснащенном ПЦР-боксом.
4.2.12. При необходимости одновременного использования для детекции продуктов амплификации метода электрофореза и метода гибридизационного анализа следует выделить в помещении детекции отдельную рабочую зону для проведения гибридизационного анализа. В этом случае оборудование и принадлежности для каждого вида детекции маркируют применительно к каждой зоне. Не допускается использовать для проведения гибридизационного анализа пипетки и посуду, предназначенные для электрофореза.
4.2.13. Планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала. Следует полностью исключить воздухообмен между помещением детекции продуктов амплификации и другими помещениями.
4.2.14. Лабораторию оборудуют водопроводом, канализацией, электричеством и отоплением в соответствии с СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами». Все помещения лаборатории обеспечивают достаточным естественным и искусственным освещением.
4.2.15. При строительстве новых или реконструкции имеющихся ПЦР-лабораторий помещения оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией. Разница в давлении воздуха в помещениях ПЦР-лаборатории достигается за счет различий в кратности воздухообмена в них. Кратность воздухообмена должна соответствовать значениям, приведенным в таблице.
| Наименование помещения | Кратность воздухообмена (куб. м/ч) |
|
| приток | вытяжка | |
| Зона приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала |
5 | 6 |
| Зона выделения нуклеиновых кислот (НК) | 5 | 6 |
| Зона приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР |
5 | 5 |
| Зона детекции продуктов амплификации | 5 | 7 |
4.2.16. При необходимости в ПЦР-лаборатории могут быть установлены кондиционеры в соответствии с СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами».
4.2.17. Внутреннюю отделку помещений выполняют в соответствии с их функциональным назначением. Поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы не должны быть скользкими.
4.2.18. Лабораторная мебель должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств. Поверхность столов не должна иметь трещин и швов.
4.2.19. Помещения на всех этапах ПЦР-анализа оборудуют бактерицидными лампами в соответствии с «Методическими указаниями по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях» N 11-16/03-06 от 28.02.95. Бактерицидные лампы в помещениях ПЦР-лаборатории устанавливают из расчета 2,5 Вт/куб. м.
4.2.20. Помещения лаборатории должны быть непроницаемы для грызунов и насекомых.
4.2.21. ПЦР-лабораторию обеспечивают средствами пожаротушения.
4.3. Требования к лабораторному оборудованию
4.3.1. Комплект лабораторного оборудования определяют с учетом используемых наборов реагентов для выделения ПК, амплификации и детекции результатов исследований. Помещение для каждого этапа проведения ПЦР обеспечивают своим набором лабораторного оборудования (Прилож. 2).
4.3.2. Приборы, оборудование и средства измерения, используемые в работе лаборатории, должны быть технически исправны, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации. Средства измерения регулярно подвергают метрологическому контролю. Используемые приборы должны соответствовать нормам безопасности и электромагнитной совместимости.
4.3.3. Для проведения исследования используют приборы и расходные материалы (пробирки, наконечники к микродозаторам), исключающие возможность перекрестной контаминации исходного материала, выделенных НК и продуктов ПЦР. Для этого используют:
— термостаты с твердотельным термоблоком;
— пробирки с плотно закрывающимися крышками;
— одноразовые пробирки и наконечники к микродозаторам;
— наконечники, строго соответствующие автоматическим пипеткам, а пробирки для амплификации — термоциклерам (в соответствии с инструкцией фирмы — производителя прибора), смена наконечников после завершения каждой манипуляции является обязательной;
— специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок, устанавливаемые на рабочих местах.
4.3.4. Микродозаторы, рабочая поверхность и наружная поверхность корпуса приборов должны быть устойчивы к действию моющих и дезинфицирующих средств и ультрафиолетового излучения.
4.3.5. Для каждого этапа проведения ПЦР-исследований необходимо предусмотреть наличие холодильников (Прилож. 2):
— в комнате приема материала от 4 до 8 град. С, минус 20 град. С (для хранения исследуемых проб);
— в комнате выделения НК от 4 до 8 град. С и минус 20 град. С — для хранения набора выделения НК; от 4 до 8 град. С — для хранения препаратов НК; не допускается хранение препаратов НК в одном холодильнике с компонентами набора для выделения НК;
— в комнате ПЦР-амплификации от 4 до 8 град. С и минус 20 град. С — для хранения наборов обратной транскрипции и амплификации НК;
— в комнате детекции продуктов амплификации от 4 до 8 град. С — для хранения наборов электрофоретической детекции и ГиФА.
5. Требования к проведению работ
5.1. Не допускается проведение исследований методом ПЦР в помещениях, где осуществляют работы по накоплению ПБА и генно-инженерные работы.
5.2. Работу с ПБА методом ПЦР выполняют специалисты с высшим и средним специальным образованием, прошедшие подготовку на лицензированных курсах специализации (повышения квалификации) по молекулярно-генетическим (ПЦР) методам диагностики.
5.3. Персонал допускают к работе с ПБА только после проведения инструктажа по соблюдению требований биологической безопасности.
5.4. В ПЦР-лаборатории, выполняющей работы с ПБА, используют дезинфицирующие средства, разрешенные к применению в установленном порядке.
5.5. Каждое помещение для проведения исследований методом ПЦР оснащают индивидуальным набором соответствующего лабораторного оборудования, расходных материалов и одежды, используемых только в данном помещении.
5.6. При проведении исследований методом ПЦР неукоснительно соблюдают следующие правила последовательной обработки материала:
5.6.1. Весь поступающий материал направляют в комнату приема материала.
5.6.2. Поступивший материал маркируют и регистрируют в специальном журнале.
5.6.3. Первичную обработку материала (взятие, маркировка и центрифугирование проб и др.) проводят только в комнате приема биологического материала.
5.6.4. В помещение выделения НК материал доставляют только в закрытых одноразовых пробирках в виде маркированных аликвот.
5.6.5. Передачу и доставку аликвот проб обработанного и обеззараженного материала, а также пробирок с продуктами ПЦР из одного помещения в другое осуществляют в закрывающихся металлических или пластмассовых контейнерах.
5.6.6. После проведения детекции и учета результатов исследования пробирки с продуктами ПЦР и использованные наконечники к микродозаторам подвергают первичной обработке дезинфицирующими растворами, вызывающими деградацию ДНК (например, 0,2%-ный раствор ДП-2Т или другие аналогичные ему, разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке). Процедуру проводят непосредственно в комнате учета результатов амплификации.
5.6.7. Окончательную дезактивацию использованных расходных материалов и реагентов (гель, буфер для электрофореза) производят в автоклавной комнате.
5.6.8. Соблюдают поточность продвижения исследуемого материала и его производных (пробы ДНК или РНК, продукты ПЦР).
5.7. Строго соблюдают условия хранения всех реагентов и образцов ДНК согласно инструкции к набору реагентов. Образцы ДНК хранят отдельно от реагентов. Не допускается использование реагентов с истекшим сроком годности или хранившихся в условиях, не соответствующих требованиям, изложенным в инструкциях.
5.8. По окончании работы все объекты, содержащие ПБА, убирают в хранилища (холодильники, шкафы и т.д.), после чего рабочие поверхности в обязательном порядке подвергаются дезинфекции.
5.9. Остатки ПБА и посуду, использованную на этапах приема, разбора и первичной обработки материала, подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот, приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР, собирают в закрывающиеся емкости и передают в автоклавную. Слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть не допускается.
5.10. Перенос ПБА и использованной посуды для обеззараживания осуществляют в закрывающихся емкостях, исключающих инфицирование во время транспортирования.
5.11. Во всех помещениях лаборатории регулярно проводят влажную уборку. Каждую рабочую зону ПЦР-анализа обеспечивают индивидуальным промаркированным набором уборочного инвентаря. Не допускается использовать уборочный инвентарь для уборки других помещений.
5.12. Сотрудников каждой рабочей зоны обеспечивают спецодеждой: медицинским халатом, шапочкой, перчатками и сменной обувью. При работе в помещении детекции продуктов амплификации следует надевать бахилы. Перемещение одежды из зоны в зону категорически не допускается. Рекомендуется использование одноразовой одежды.
Обработку рабочей одежды из зоны детекции продуктов амплификации проводят отдельно от одежды из других зон. Обеззараживание рабочей одежды проводят в соответствии с СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами».
5.13. Лабораторию обеспечивают аптечкой стандартной комплектации для оказания первой медицинской помощи.
6. Требования к обработке помещений
и обеззараживанию материала
6.1. Обработку помещений проводят в соответствии с требованиями СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами». В комнатах, в которых проводят работу с выделенными НК, рабочие поверхности, штативы, оборудование следует обеззараживать ежедневно ультрафиолетовым излучением в течение 1 ч. Полы ежедневно подвергают влажной уборке с применением дезинфицирующих средств, регламентированных санитарными правилами. Перед началом работы рабочую поверхность столов дополнительно обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом. Ежемесячно проводят профилактическую обработку рабочей поверхности столов и штативов 1 N соляной кислотой.
6.2. Обеззараживание проб проводят в соответствии с МУ 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом ПЦР».
7. Действия при возникновении контаминации
лаборатории нуклеиновыми кислотами
7.1. При возникновении контаминации лаборатории проводят следующие мероприятия (Прилож. 3):
— утилизацию всех находящихся в «контаминированной» зоне реактивов;
— утилизацию исследуемых материалов на всех промежуточных стадиях обработки (кроме исходной);
— генеральную уборку, химическую и ультрафиолетовую дезинфекцию всех поверхностей лабораторных помещений;
— дезинфекцию мебели, рабочих поверхностей, а также поверхностей корпусов приборов и оборудования химическим методом и ультрафиолетовым излучением;
— обработку паром под давлением всей спецодежды «контаминированной» зоны.
7.2. Случаи контаминации регистрируют в специальном журнале с указанием мероприятий по ее устранению и результатов внутрилабораторного контроля.
7.3. Проведение ПЦР-исследований до завершения деконтаминационных мероприятий не допускается.
8. Оценка и контроль качества работы ПЦР-лаборатории
8.1. В ПЦР-лаборатории, проводящей работы с ПБА III-IV групп патогенности, проводят внутрилабораторный контроль качества дезинфекции, исследование смывов с рабочих поверхностей и воздушной среды боксов.
8.2. В ПЦР-лаборатории проводят внутрилабораторный контроль качества ПЦР-исследований. ПЦР-лаборатория принимает участие во внешнелабораторном контроле качества деятельности генодиагностических лабораторий.
8.3. Внутрилабораторный контроль проводят с периодичностью, зависящей от объема выполняемой работы и определяемой руководителем лаборатории, но не реже одного раза в квартал.
8.4. Контроль осуществляют путем исследования шифрованных аттестованных контрольных панелей, содержащих «положительные» и «отрицательные» пробы.
8.5. Количество проб зависит от объема проводимых исследований и должно быть достаточным для оценки работы сотрудников и выявления контаминированных участков лаборатории.
8.6. Для выявления возможной контаминации лаборатории нуклеиновыми кислотами контроль проводят путем взятия смывов с поверхностей. Смывы с поверхностей берут стерильными ватными тампонами (зондами). Перед взятием смывов тампоны (зонды) смачивают стерильным физиологическим раствором или ТЕ-буфером (10 mM Tris, 1 mM ЭДТА), после чего вращательными движениями протирают рабочие поверхности. После взятия смыва зонд помещают в микропробирки типа «эппендорф» с 300-400 мкл ТЕ-буфера, вращают в течение 10-15 с, избегая разбрызгивания раствора, и, отжав избыток жидкости о стенки пробирки, удаляют.
Полученные суспензии центрифугируют при 8000 g (12000 об./мин.) в течение 1 мин. Надосадочную жидкость отбирают наконечником с аэрозольным барьером в микропробирку объемом 1,5 мл. Для выделения НК используют 0,1-0,2 мл надосадочной фракции.
8.7. В качестве критериев оценки качества исследований методом полимеразной цепной реакции в лаборатории учитывают результаты внутреннего и внешнего лабораторного контроля, а также отсутствие случаев лабораторной контаминации нуклеиновыми кислотами.
Приложение N 1
(справочное)
ТЕРМИНЫ, ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
Биологическая безопасность — система организационных, медико-биологических и инженерно-технических мероприятий и средств, направленных на защиту работающего персонала, населения и среды обитания человека от воздействия патогенных биологических агентов.
НК — нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК).
Генетические маркеры — нуклеотидные последовательности с известной первичной структурой, которые позволяют проводить идентификацию анализируемой НК.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод обнаружения специфического участка НК в исследуемом биологическом материале путем амплификации in vitro.
Амплификация — процесс многократного копирования специфического участка ДНК (кДНК), ограниченного (фланкированного) праймерами.
Ампликоны — продукты ПЦР, синтезируемые в процессе амплификации копии ДНК-мишени.
Лабораторная контаминация НК — механический занос положительно реагирующих НК, прежде всего ампликонов, в исследуемые образцы, приводящий к ложноположительным результатам.
Приложение N 2
(рекомендуемое)
ПЕРЕЧЕНЬ
ОБОРУДОВАНИЯ ПЦР-ЛАБОРАТОРИИ
Для обработки материала и выделения НК
1. Центрифуга для пробирок объемом 5-100 мл.
3. Микроцентрифуга от 12 до 16000 g для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл.
4. Твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с диапазоном рабочих температур 25-100 град. С.
5. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.
6. Одноразовые полипропиленовые микроцентрифужные пробирки с завинчивающимися или плотно закрывающимися крышками объемом 1,5 мл.
7. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 200 и до 1000 мкл.
8. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 мкл.
9. Штативы для наконечников, микропробирок объемом 1,5 мл.
10. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 град. С, минус 20 град. С.
11. Емкость с дезинфицирующим раствором.
Для приготовления ПЦР-смеси и проведения амплификации
1. Настольный бокс с бактерицидной лампой.
3. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.
4. Одноразовые полипропиленовые пробирки для амплификации объемом 0,5 (0,2) мл.
5. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 100 мкл.
6. Штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 (0,2) мл.
7. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 град. С, минус 20 град. С.
8. Емкость для сброса отработанных расходных материалов.
Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР
1. Камера для горизонтального электрофореза.
2. Источник постоянного тока с напряжением 150-460 В.
3. Трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей.
4. Видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов.
5. Компьютер для анализа результатов электрофореза.
6. Микроволновая печь для плавления агарозы.
7. Колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы объемом 250 мл.
8. Мерный цилиндр объемом 1 л.
9. Штатив для микропробирок на 0,5 мл.
10. Отдельная автоматическая пипетка 10-40 мкл.
11. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 мкл в штативе.
12. Холодильник с камерой, поддерживающей температуру от 2 до 8 град. С.
13. Емкость для сброса отработанных расходных материалов.
Для гибридизационно-ферментной детекции продуктов ПЦР
1. Термостат планшетный, поддерживающий температуру 37 град. С.
2. Вошер (не обязательно).
3. Планшетный спектрофотометр.
4. Компьютер (должен быть связан через компьютерную сеть с компьютером, располагающимся в чистой зоне и предназначенным для анализа результатов гибридизации).
5. Восьмиканальная пипетка до 200 мкл.
6. Отдельный набор одноканальных автоматических пипеток переменного объема.
7. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема.
8. Мерный цилиндр объемом 1 л.
9. Холодильник с камерой, поддерживающей температуру от 2 до 8 град. С.
10. Емкость для сброса отработанных расходных материалов.
Приложение N 3
(рекомендуемое)
ДЕЙСТВИЯ ПРИ КОНТАМИНАЦИИ ЛАБОРАТОРИИ
НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ
1. Сотрудников, проводящих мероприятия по деконтаминации, обеспечивают одноразовыми халатами, шапочками, бахилами и перчатками, одноразовой ветошью, емкостями для приготовления необходимых количеств моющих и дезинфицирующих растворов.
2. Каждую зону лаборатории обрабатывают работающие в ней сотрудники.
3. Для обработки каждой зоны используют новый набор уборочного инвентаря.
4. Каждую зону лаборатории разбивают на участки уборки, например:
— участок 1 — бокс биологической безопасности и оборудование внутри него;
— участок 2 — внешние поверхности бокса биологической безопасности;
— участок 3 — шкафы для расходного материала;
— участок 4 — холодильники для хранения реактивов, образцов проб;
— участок 5 — оборудование, которое используют в работе, но стоит вне бокса биологической безопасности;
— участок 6 — поверхности помещения (стены, окна, батареи, потолок, двери и т.д.);
5. Обработку проводят от участка к участку последовательно. Каждый участок обрабатывают отдельной ветошью. Перед обработкой персонал надевает одноразовую одежду, бахилы, шапочки, перчатки; готовит моющие и дезинфицирующие растворы.
6. Поверхности каждого участка вначале обрабатывают моющим раствором для удаления жировых загрязнений, после чего остатки моющего средства удаляют ветошью, смоченной водой.
7. Затем на поверхность наносят на 30 минут дезинфицирующий раствор (например, 0,2%-ный раствор ДП-2Т или аналогичные ему, разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке). Остатки дезинфицирующего средства тщательно удаляют ветошью, смоченной водой.
8. После завершения указанной обработки проводят обеззараживание ультрафиолетовым излучением влажных поверхностей в течение 1 ч.
9. Мероприятия, описанные в п.п. 7 и 8, повторяют еще раз.
10. Каждый последующий этап обработки проводят в новой одноразовой одежде (халат, шапочка, бахилы, перчатки) с использованием новой ветоши. Для удаления остатков нанесенных на поверхность дезинфицирующих средств ветошь тщательно прополаскивают в чистой воде, обрабатываемую поверхность протирают несколько раз. После каждого этапа обработки ветошь утилизируют.
11. По завершении деконтаминации берут повторные смывы, которые исследуют на наличие НК возбудителей инфекционных заболеваний, диагностику которых наиболее часто осуществляют в данной лаборатории, а также на выявление НК возбудителей, имеющих короткие — менее 300 п.н. — специфические продукты амплификации (длина специфического фрагмента указана в инструкциях к тест-системе).
12. Для проведения смывов стерильный зонд с ватным тампоном смачивают в физиологическом растворе или ТЕ-буфере (10 mM Tris, 1 mМ ЭДТА), после чего вращательными движениями протирают рабочие поверхности оборудования, мебели, дверных ручек и косяков, телефонов и т.п. Особое внимание уделяют помещениям совместного посещения работников зоны детекции продуктов амплификации и других сотрудников лаборатории (столовая, санузел и т.п.). После взятия смыва зонд помещают в микропробирки типа «эппендорф» с 300-400 мкл ТЕ-буфера, вращают в течение 10-15 с, избегая разбрызгивания раствора, и, отжав избыток жидкости о стенки пробирки, удаляют.
13. В случае получения в образцах смывов положительных результатов ПЦР-анализа обработку повторяют.
14. Загрязненный расходный материал (пробирки, наконечники и т.п.) утилизируют.
Уважаемые коллеги!
Все методические рекомендации, пособия и т.д. интеллектуальная собственность авторов, Ассоциации и являются архивными материалами разных лет!!
Источник: pamsk.ru
Что такое пцр в строительстве
Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала,
инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности
Дата введения: с момента утверждения
1. РАЗРАБОТАНЫ: Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (М.П.Шевырева, Ю.М.Федоров); Центром по генной диагностике особо опасных инфекционных заболеваний Минздрава России на базе Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (В.В.Кутырев, А.Н.Куличенко, Н.А.Осина, И.Н.Шарова, М.Н.Ляпин, И.Г.Дроздов); Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Е.Н.Беляев, И.В.Брагина, А.А.Ясинский, Э.Ф.Опочинский, Т.В.Воронцова, М.В.Зароченцев); ЦНИИ эпидемиологии Минздрава России (В.И.Покровский, Н.А.Семина, Г.А.Шипулин, Е.Н.Родионова); Противочумным центром Минздрава России (В.Е.Безсмертный, С.М.Иванова, Ю.А.Панин); ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Т.А.Бектимиров, Р.А.Волкова, М.С.Воробьева, Л.В.Саяпина); Ростовским-на-Дону научно-исследовательским противочумным институтом (И.Ю.Сучков, С.О.Водопьянов, Б.Н.Мишанькин); Ставропольским научно-исследовательским противочумным институтом (Е.И.Еременко, А.Ф.Брюханов, О.И.Цыганова); Иркутским научно-исследовательским противочумным институтом (С.В.Балахонов, М.Ю.Шестопалов); ГНЦ биотехнологии и вирусологии «Вектор» (Г.М.Игнатьев, Н.Л.Максимов, А.А.Неверов, В.А.Терновой, С.В.Нетесов); Биоком (А.Б.Комаров).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Министерстве здравоохранения Российской Федерации (протокол N 20 от 2 декабря 2003 г.).
3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 5 декабря 2003 г.
4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
1. Область применения
— диагностические (исследование объектов окружающей среды и клинического материала, в том числе от больных с подозрением на ТОРС);
— производственные (работы по производству и контролю генодиагностических препаратов при условии соблюдения требований GMP).
1.2. Методические указания определяют принципы организации лабораторий и этапы выполнения ПЦР-анализа: взятие проб, первичная обработка, хранение, условия транспортирования, обеззараживание материала, выделение нуклеиновых кислот, проведение ПЦР (ОТ-ПЦР), учет и регистрация результатов при исследовании биологического материала, пищевых продуктов, материала из объектов окружающей среды.
1.3. Методические указания регламентируют выполнение исследований с использованием ПЦР-анализа, осуществляемого сертифицированными тест-системами и оборудованием и предусматривающего учет результатов методом электрофореза или гибридизационно-ферментного анализа (ГиФА).
2. Нормативные ссылки
2.1. Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» СП 1.3.1285-03.
2.2. Санитарно-эпидемиологические правила «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами» СП 1.2.1318-03.
2.3. Санитарные правила и нормы «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений» СанПиН 2.1.7.728-99.
2.4. Методические указания «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом ПЦР» МУ 3.5.5.1034-01. М., 2001.
2.5. «Методические указания по детекции патогенной микрофлоры в клиническом материале, пищевых продуктах, объектах внешней среды и генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции». Госкомсанэпиднадзор России от 18.10.96 N 01-19/123-17.
2.6. Методические указания «Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды». МЗ СССР от 01.09.86 и Госагропром СССР от 01.09.86.
2.10. «Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции». М.,1995.
2.11. Временные методические рекомендации «Лабораторная диагностика «атипичной пневмонии» (SARS) методом ПЦР», утв. Минздравом России 03.05.03.
2.12. Руководство по профилактике чумы. Саратов: Слово, 1992.
2.13. Руководство «Использование ультрафиолетового излучения для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях». Р 3.1.683-98, МЗ РФ.
2.14. Инструкция по проектированию санитарно-эпидемиологических станций СН 535-81. М.: Стройиздат, 1982.
3. Общие положения
3.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации (многократном увеличении числа копий) фрагмента ДНК-мишени в условиях in vitro и позволяет обнаружить специфичный участок генома микроорганизма.
3.2. Аналитическая чувствительность тест-систем для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов методом ПЦР составляет 1х10-1×10 м.к. (геномных эквивалентов)/мл, специфичность — 85-100%, возможно исследование любого биологического материала и объектов окружающей среды, время выполнения анализа 4-8 ч.
3.3. Для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов I-II групп патогенности ПЦР-анализ используют:
— в качестве экспрессного метода при исследовании материала от больного (подозрительного на заболевание) и индикации патогенных биологических агентов (ПБА) в объектах окружающей среды;
— как ускоренный предварительный тест при выполнении культурального и биологического методов исследования и для идентификации подозрительных культур;
— для определения эпидемиологической значимости изолятов на основании выявления генетических маркеров вирулентности, например, ctxA- и tcpA-генов у возбудителя холеры;
— в научных целях для генотипирования штаммов или их ретроспективного анализа.
4. Требования к организации работ
4.1. Проведение исследований по выявлению ДНК (РНК) микроорганизмов I-II групп патогенности сопряжено с необходимостью одновременного обеспечения правил биологической безопасности работ и требований к организации и проведению ПЦР-анализа с целью предотвращения контаминации исследуемых проб нуклеиновыми кислотами (НК).
4.2. Противоэпидемический режим работы при ее организации и выполнении должен быть обеспечен в соответствии с СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», регламентирующими работу с микроорганизмами I-II групп патогенности.
4.3. Все этапы исследования материала, зараженного или подозрительного на зараженность вирусами I группы, проводят в условиях максимально изолированных лабораторий с использованием изолирующих средств индивидуальной защиты или в боксах биологической безопасности III класса в защитном костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками.
4.4. Исследования материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности, методом ПЦР проводят в организациях, имеющих лицензию на деятельность, связанную с возбудителями инфекционных заболеваний человека, в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения соответствующих работ (с указанием конкретных видов микроорганизмов). В этой же лаборатории могут проводиться ПЦР-исследования с микроорганизмами III-IV групп патогенности.
4.5. Допускается проведение исследований крови методом ПЦР на бруцеллез, парентеральные вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекцию в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с возбудителями III группы патогенности, выданное в установленном порядке.
4.6. Передачу исследуемого материала в другие организации проводят в соответствии с п.п.2.1.2 и 2.8.20 СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».
4.7. Работу по ПЦР-диагностике организует специалист с высшим образованием, прошедший обучение на лицензированных курсах специализации (повышения квалификации) по работе с ПБА I-II групп патогенности и по ПЦР-диагностике.
5. Требования к помещению и оборудованию ПЦР-лабораторий
5.1. Помещения, в которых проводят исследования на наличие НК микроорганизмов I-II групп патогенности, размещают в «заразной» зоне лаборатории, проводящей диагностические и другие исследования с указанными микроорганизмами. При наличии возможности помещения располагают в виде отдельного блока. При строительстве новых или реконструкции имеющихся помещений лабораторию ПЦР размещают в отдельно стоящем здании (изолированной части здании) с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и учетом особенностей устройства вентиляционной системы ПЦР-лаборатории, изложенных в п.5.19 настоящих методических указаний.
5.2. Рабочая зона ПЦР-лаборатории в соответствии с этапами ПЦР-анализа должна включать следующий минимальный набор последовательно расположенных самостоятельных помещений (прилож.1) или отдельно выделенных рабочих зон (в составе других функциональных помещений):
— приема, разборки, первичной обработки материала;
— подготовки проб, выделения нуклеиновых кислот (НК);
— приготовления реакционных смесей, проведения ПЦР и обратной транскрипции (ОТ);
— учета результатов методом электрофореза или ГиФА.
5.3. Комнату выделения НК располагают вблизи от комнаты приема материала, а помещение для учета результатов — по возможности в отдалении от других перечисленных помещений для обеспечения условий, исключающих занос в них продуктов амплификации (ампликонов) с воздушным потоком.
5.4. Не допускается выполнение ПЦР-исследований в помещениях для проведения работ с использованием культуральных (накопление патогенных биологических агентов) и генно-инженерных методов, в том числе связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид.
5.5. Зону приема, регистрации, сортировки, первичной обработки материала (объединение или разделение проб, центрифугирование, инактивацию и т.д.) располагают в комнате приема материала блока для работы с инфицированными животными или в отдельной боксированной комнате. В этих же помещениях может проводиться обработка проб к другим видам исследований (бактериологическое, вирусологическое, серологическое и т.д.). При наличии возможности в помещении устанавливают бокс биологической безопасности III класса защиты (допускается также использование бокса 2ШНЖ, например, фирмы «Изотоп» и др.) или бокс безопасности II класса защиты.
5.6. Зону по подготовке проб и выделению нуклеиновых кислот размещают в боксированном помещении (микробиологический бокс с предбоксом) или в комнате заражения и вскрытия животных. Работу проводят в боксе биологической безопасности II или III класса. В рабочей зоне располагают оборудование и предметы, необходимые только для предварительной обработки, выделения НК (примерный перечень представлен в прилож.2).
5.7. Зону приготовления реакционных смесей и проведения ОТ и ПЦР-амплификации располагают в боксированном помещении или боксе биологической безопасности II класса (или ПЦР-боксе) — для подготовки реакционных смесей для ОТ и ПЦР.
5.8. Работу по подготовке реакционных смесей для ПЦР и ОТ-ПЦР проводят до доставки в бокс проб, поступающих из зоны выделения НК. Смесь может быть приготовлена также за пределами помещений лаборатории, предназначенных для работы с заразным материалом, например, в комнате (боксе) для розлива питательных сред.
5.9. При необходимости этап подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот может выполняться в одной комнате с этапом ПЦР при наличии в ней бокса биологической безопасности II или III класса защиты для выделения НК и бокса биологической безопасности II класса (или ПЦР-бокса) — для подготовки реакционных смесей для ОТ и ПЦР. Каждый бокс рассматривается как соответствующая рабочая зона.
5.10. Зону детекции результатов располагают в боксированном помещении. При отсутствии боксированного помещения работу проводят в отдельной комнате, при возможности в ПЦР-боксе.
5.11. При одновременном использовании двух методов детекции продуктов амплификации — электрофоретического и ГиФА — следует выделить отдельные помещения или две рабочие зоны. Оборудование и принадлежности для каждого вида анализа маркируют применительно к каждой зоне. Обмен посудой и пипетками между зонами не допускается.
5.12. Помещения ПЦР-лаборатории покрывают кафелем (пол, стены) или масляной краской (стены, потолок), устойчивой к действию моющих и дезинфицирующих средств.
5.13. Во всех помещениях устанавливают бактерицидные лампы. Рекомендуется дополнительная установка переносного ультрафиолетового бактерицидного облучателя-рециркулятора.
5.14. Окна должны быть плотно закрыты. Для защиты рабочих столов от попадания прямого солнечного света используют светозащитные пленки из материала, устойчивого к дезинфицирующим средствам. Использование жалюзи не рекомендуется из-за адсорбции пыли.
5.15. Каждая рабочая зона должна иметь свой набор мебели, лабораторного оборудования, реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, защитной одежды, обуви, резиновых перчаток, уборочного инвентаря и пр., используемых только в данной комнате (рабочей зоне).
5.16. Имущество каждой рабочей зоны должно иметь маркировку указанной зоны. Применение его в других помещениях или для других видов исследований не допускается.
5.17. В рабочих зонах должен быть свой набор холодильников (прилож.2):
— в комнате приема материала от 4 до 8 °С, минус 20 °С и минус 70 °С (при необходимости длительного хранения материала);
— в комнате выделения нуклеиновых кислот от 4 до 8 °С и минус 20 °С для хранения набора выделения НК; от 4 до 8 °С — для хранения препаратов НК; не допускается хранение проб материала или препаратов НК в одном холодильнике с компонентами набора для выделения НК;
— в комнате ПЦР-амплификации от 4 до 8 °С и минус 20 °С — для хранения наборов обратной транскрипции и амплификации НК;
— в комнате детекции продуктов амплификации от 4 до 8 °С — для хранения наборов электрофоретической детекции и ГиФА.
5.18. Помещения ПЦР-лаборатории оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией, соответствующей требованиям п.п.2.3.16 и 2.4.3 СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».
5.19. При выполнении ПЦР воздухообмен внутри и между помещениями может повышать опасность контаминации проб из-за вероятности проникновение молекул НК и продуктов амплификации через фильтры. Снижение этой опасности достигается указанной ниже системой вентиляции лаборатории:
— следует полностью исключить воздухообмен между помещением для детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) и остальными комнатами ПЦР-лаборатории, а также другими помещениями организации (давление воздуха в пост-ПЦР-помещении должно быть ниже, чем в указанных помещениях);
Источник: docs.cntd.ru